Diagnostic parasitologique du paludisme

I. Diagnostic microscopique classique : frottis, goutte épaisse

Ils permettent d'établir un diagnostic d'espèce en ne nécessitant qu'un microscope optique et des colorants d'un coût modéré. La qualité du résultat dépend cependant beaucoup de l'ex­périence de la personne réalisant cet examen. Un rappel de la technique et des caractères de chaque espèce plasmodiale est essentiel.

1. Technique du frottis sanguin

Le prélèvement doit se faire, soit par prélève­ment capillaire au bout du doigt avec confec­tion immédiate du frottis et de la goutte épais­se, soit par ponction veineuse avec prélève­ment dans un tube contenant un anticoagulant (par exemple E.D.T.A.) et réalisation secon­daire des lames d'examen. Le frottis doit être effectué avec soin de manière à ne comporter qu'une couche cellulaire.

La coloration ne doit pas comporter de dépôts de colorants qui gêneraient considérablement la lecture des lames et pourraient être cause d'erreur.

Le frottis, après coloration au Giemsa (*) sera lu avec la plus grande attention, à l'immersion, pendant au moins vingt minutes, avant de rendre un résultat négatif. Le fait de trouver un élément parasitaire ne justifie pas l'arrêt de la lecture de la lame, il peut en effet exister un polyparasitisme.

• Recouvrir les lames d'alcool méthylique pen­dant 3 minutes. Puis recouvrir les lames de Giemsa pendant 20 minutes pour le Giemsa lent (10 minutes pour le Giemsa rapide).

• Rincer à l'eau neutre.

• Sécher.

• Lire la lame à l'immersion.

Solution de Giemsa : Giemsa : 1 ml, eau neutre q.s.p. : 10 ml

2. Technique de la goutte épaisse

Il s'agit d'une technique de concentration utili­sable également pour les recherches de trypa­nosomes et microfilaires :

Dépôt du sang

Déposer, sur une lame de verre dégraissée, une grosse goutte de sang (2 fois le volume uti­lisé pour un frottis).

Défibrination

En cas de prélèvement capillaire, pour empê­cher la coagulation, avec le coin d'une autre lame ou la pointe d'un vaccinostyle, étaler régulièrement le sang sur une surface de 1 cm de diamètre, en tournant régulièrement pen­dant 2 minutes.

Séchage

Retourner la lame et laisser sécher à plat sur un support,

• soit pendant 24 heures à la tem­pérature ambiante,
• soit pendant une heure à l'étuve à 37°C.

Ne jamais fixer à la chaleur ou à l'alcool.

Déshémoglobinisation

Recouvrir abondamment la goutte épaisse du mélange :

• Giemsa : 3 gouttes
• Eau neutre : 2 ml

Laisser agir pendant 5 à 10 minutes jusqu'à décoloration complète (pour les microfilaires, il est préférable de remplacer l'eau neutre par du sérum physiologique). Fixer ensuite à l'al­cool méthylique.

Coloration

Jeter le liquide avec précaution (risque de décollement de la pellicule de sang) et rempla­cer immédiatement par le mélange :

• Giemsa : 1 ml
• Eau neutre q.s.p. : 10 ml

Laisser agir 20 minutes puis rejeter le liquide avec précaution.

Laver à l'eau du robinet, en faisant couler le liquide sur la face de la lame qui ne porte pas la coloration.
Sécher à l'air.

3. Etapes successives du diagnostic parasitologique

Reconnaissance de l'hématozoaire par

• sa situation intraérythrocytaire (pour toutes les espèces, à tous les stades de leur évolution) ;
• les caractères généraux de la forme plas­modiale :
  • le cytoplasme très basophile (exception avec le gamétocyte mâle souvent lilas ou rose),
  • le noyau : azurophile (rouge rubis ou grenat) - unique ou fragmenté,
  • les inclusions pigmentaires provenant du catabolisme de l'hémoglobine, l'hé­mozoïne ou pigment noir, de forme et d'abondance croissantes au cours de l'évolution du plasmodium, non visible dans les trophozoïtes jeunes (sauf chez Pl. malariae), au maximum dans les gamétocytes.

Détermination du stade évolutif du parasite

L'aspect du parasite varie en effet avec l'espèce en cause et avec son stade d'évolution (c'est-à-dire avec l'âge du parasite).

Formes asexuées :

• Trophozoïtes : ce sont les formes les plus jeunes, mobiles, forme annulaire pour toutes les espèces. Aspect de bague à châton : anneau bleu, châton rouge, partie interne incolore (vésicu­le nutritive). Ces formes très jeunes sont sensiblement identiques pour toutes les espèces.
• Schizontes : formes parasitaires débutant au moment ou la chromatine commence à se diviser. En vieillissant les schizontes perdent leur mobilité, augmentent de taille et subis­sent des divisions nucléaires. A maturité ils prennent la forme de rosaces.
• Rosaces : la rosace occupe la totalité de l'hé­matie parasitée. Les noyaux sont rejetés à la périphérie, le pigment parasitaire est ramas­sé en amas central. A maturité complète, l'hématie éclate et libère un nombre variable de mérozoïtes.
• Mérozoïtes. Ils sont de forme ovalaire ou arrondie ; ils possèdent un cytoplasme bleu et une masse de chromatine rouge ou violet­te après coloration (= noyau).

Formes sexuées (gamétocytes) :

Formes rondes ou ovalaires remplissant presque entièrement l'hématie. Ils se rencon­trent plus tardivement que les formes asexuées. Leur diagnostic est important pour l'épidémio­logie et la prophylaxie du paludisme.

• Microgamétocytes (mâles) : cytoplasme pâle, lilas ou rose. Les noyaux de Pl.vivax, PI. malariae et PI. ovale, sont en masses granu­leuses colorées en rouge par le Giemsa.
• Macrogamétocytes (femelles) : cytoplasme bleu sombre. Pl. vivax, Pl. ovale et Pl. mala­riae : noyau dense, coloré en rouge par le Giemsa.

Identification de l'espèce en cause

Le frottis mince permet de mettre en évi­dence tous les détails morphologiques du parasite et de l'hématie parasitée.

La goutte épaisse permet un enrichissement important en parasites, mais la lecture est plus difficile. Les parasites apparaissent plus petits, leurs couleurs sont plus vives, les contours sont moins réguliers ; les parasites sont libérés des hématies et donc fragilisés.

4. Diagnostic d'espèce

Plasmodium falciparum

Frottis minces

Dans le sang périphérique, on ne trouve habi­tuellement que des trophozoïtes de forme annulaire (le développement se poursuivant ensuite dans les capillaires profonds) et des gamétocytes.

• Trophozoïtes jeunes : aspect typique de bague à châton, de petite taille, anneau très mince, taille 1/3 à 1/5 de l'hématie.
• Dans cette espèce on observe souvent des formes à 2 noyaux pour un seul anneau et plusieurs parasites dans une même hématie.
• Après traitement on trouve souvent ces formes en périphérie de l'hématie, et dans certains cas le noyau rouge semble sortir de l'hématie.
• Trophozoïtes plus âgés : l'anneau bleu foncé du cytoplasme est plus élargi dans la partie opposée au noyau.
• Gamétocytes : ils sont présents plus tardive­ment ou après traitement. Ils sont très typiques dans cette espèce : forme de crois­sant ou de banane, mais toujours intra-éry­throcytaire ; ils remplissent l'hématie dont il est souvent difficile de voir le contour.
• Microgamétocyte : cytoplasme lilas ou rose, forme trapue, extrémité arrondie, forme de banane - noyau coloré en rouge allongé - présence de grains de pigment noir assez dispersés dans le cytoplasme.
• Macrogamétocyte : cytoplasme bleu intense, forme plus élancée, en croissant. Noyau rouge condensé entouré de nombreux grains de pigment.

Aspect des hématies parasitées. Toutes les hématies, quel que soit leur âge, peuvent être parasitées. Elles sont de taille et d'aspect normaux, normochromes, parfois bleutées, avec un contour crénelé.

Dans l'hématie, on peut parfois observer des granulations irrégulières appelées taches de Maurer, en coup d'ongle, de couleur rouge brique.

Aspect général du frottis.

• Au cours des accès simples, le frottis est monotone constitué uniquement de tropho­zoïtes avec un polyparasitisme fréquent des hématies.
• Lors des accès pernicieux, on constate un envahissement important des hématies par les trophozoïtes et souvent la présence de schizontes et de rosaces qui passent dans le sang périphérique. Les rosaces renferment de nombreux mérozoïtes (8 à 32), en géné­ral de 16 à 24. L'hématie garde une taille normale. Le problème de l'identification des accès pernicieux est particulièrement impor­tant, en raison de la sanction thérapeutique immédiate qu'elle doit entraîner. Il s'agit là de la seule mais vraie URGENCE PARASITO­LOGIQUE.

Pour Plasmodium falciparum il est indispen­sable de préciser l'intensité de l'infestation en calculant systématiquement le pourcentage d'hématies parasitées, ceci étant un des élé­ments de la prise en charge et du suivi du patient.

Goutte épaisse

Elle présente un intérêt dans les faibles infes­tations. C'est alors le Plasmodium le plus faci­le à reconnaître. On retrouve souvent l'anneau complet du trophozoïte, ou une partie seule­ment en raison de sa dislocation au moment de la technique (aspect en ailes d'oiseau, en point d'interrogation ou d'exclamation). Les trophozoïtes âgés conservent mieux leur cyto­logie, on retrouve l'anneau bleu et le noyau rouge. Les gamétocytes sont en général intacts et sont donc facilement reconnaissables.

Plasmodium vivax

Frottis minces

• Trophozoïtes jeunes : 2 à 4 mm avec un cytoplasme en forme d'anneau bleu clair, un noyau en général unique, rouge, plus gros que dans Plasmodium falciparum. Le noyau est rarement divisé. Les formes très jeunes ressemblent à PI. falciparum mais sont plus grandes. L'hématie est rose sau­mon.
• Trophozoïtes âgés : ils sont de grande taille : 5 mm. Au bout de 8 heures ils possèdent une activité amiboïde marquée. Ils prennent alors une forme irrégulière, fantasque et tourmen­tée dite amiboïde. Un pigment verdâtre appa­raît, réparti en masses irrégulières, fines, dans tout le cytoplasme du parasite.
• Schizontes : 6 à 7 mm, de forme ovale ou arrondie remplissant presque entièrement l'hématie distendue qui prend alors des formes variables et étranges. Le noyau est formé de grosses masses rouges de chroma­tine, irrégulièrement réparties. On trouve dans le cytoplasme du parasite un pigment brunâtre, en petits amas fins éparpillés au centre et à la périphérie.
• Rosace : le parasite occupe toute l'hématie; elle contient 12 à 18 mérozoïtes, irrégulière­ment distribués, avec un amas de pigment noir au centre.
• Gamétocytes :
  • Microgamétocytes : occupent toute l'hématie, cytoplasme lilas, gros noyau rouge rejeté sur le côté ; pigment peu abondant.
  • Macrogamétocyte : cytoplasme bleu foncé, noyau plus petit et plus compact, rouge sombre ou violet. Pigment en grains très fins, rejetés en principe à la périphérie du parasite.

Aspect des hématies parasitées

Au stade du trophozoïte âgé, l'hématie parasi­tée augmente de taille et on voit apparaître des granulations orangées ou roses dans le cytoplasme de l'hématie non occupée par le plasmodium : ce sont les granulations de Schüffner.

Au stade schizonte, l'hématie est très aug­mentée de taille, très pâle avec de nombreuses granulations de Schüffner.

Au stade rosace, les contours de l'hématie peu­vent être anguleux.

Aspect général du frottis

Très panaché, avec présence de tous les stades évolutifs. Le parasitisme est moins intense qu'avec Plasmodium falciparum.

Goutte épaisse

• Trophozoïtes jeunes : paraissent plus petits que sur les frottis. Souvent l'anneau et le noyau sont fragmentés.
• Trophozoïtes âgés : cytoplasme plus abon­dant avec présence d'hémozoïne, contours moins nets, irréguliers.
• Gamétocytes : ils sont difficiles à différencier des schizontes ; leur cytoplasme est plus régulier et ils renferment plus de pigment.

Plasmodium ovale

Frottis minces

• Trophozoïtes jeunes : anneau petit mais large, bleu foncé avec un gros noyau rouge (plus gros que dans Plasmodium malariae). Apparition rapide de grosses granulations orangées : les granulations de Schüffner. Elles sont plus précoces que dans Plasmo­dium vivax.
• Trophozoïtes âgés : forme allongée ou ovoï­de, cytoplasme bleu foncé, non amiboïde ; noyau rouge très net, gros et compact.
• Schizontes : arrondis ou ovales, situés au centre de l'hématie. Le nombre de noyaux est variable selon le degré de maturation.
• Rosaces : 4 à 12 mérozoïtes (en général 8), organisés autour d'une masse centrale de pigment.
• Gamétocytes : arrondis, pâles. Pigment en forme de bâtonnets.

Aspect des hématies parasitées

Taille normale. Lors de la confection du frot­tis, la pression provoque souvent une ovalisa­tion des hématies parasitées, avec un aspect frangé des contours.

Aspect général du frottis

Parasites en règle peu nombreux. Frottis poly­morphe : présence de trophozoïtes, schi­zontes, rosaces et gamétocytes.

Goutte épaisse

Formes rondes ou ovales, compactes. Noyaux irréguliers. Il est impossible d'établir un dia­gnostic d'espèce sur la goutte épaisse.

Plasmodium malariae

Frottis minces

• Trophozoïtes jeunes : petits, compacts. Anneau bleu foncé, épais. Dans le cytoplas­me du parasite, on trouve un grain de pigment noir.
• Trophozoïtes âgés et schizontes : formes variées, ovalaires, en bandelette ou en dra­peau, typique de l'espèce. Le trophozoïte est allongé d'un bout à l'autre de l'hématie, en position équatoriale. Pigment noir, dispersé en masses grossières, dans tout le cytoplas­me du parasite.
• Rosaces : cytoplasme plus foncé. Pigment noir rassemblé en une masse compacte au centre, entouré d'un petit nombre de méro­zoïtes (8 à 12), ovales, bleus, avec un noyau rouge régulièrement disposé à la périphérie qui donne l'aspect typique de marguerite à ces rosaces.
• Gamétocytes : ils ressemblent à ceux du Plasmodium vivax, mais ils sont plus petits, plus rares dans le sang circulant et surtout plus pigmentés (pigment grossier noirâtre).

Aspect des hématies parasitées

Elles sont légèrement rétractées avec une ten­dance à l'hyperchromie.

Aspect général du frottis

Diversité des formes évolutives. Formes très pigmentées. Abondance de pigment noir gros­sier à tous les stades, donnant un aspect sale, foncé au parasite. Seules les hématies âgées sont parasitées ce qui réduit la parasitémie, de ce fait, les parasites sont plus rares que dans les autres espèces.

Goutte épaisse

Trophozoïtes et schizontes sont difficiles à différencier de ceux de Plasmodium vivax. Par contre les rosaces sont en général nom­breuses et faciles à identifier en raison de leur aspect caractéristique en marguerite.

II. Techniques indirectes de diagnostic

La technique traditionnelle de diagnostic, basée sur la coloration par le Giemsa permet un diagnostic de certitude mais il nécessite de posséder un microscope correct et implique un microscopiste de qualité. C'est pour tenter de pallier ces inconvénients que des tech­niques de diagnostic indirect ont été mises au point.

1. Sérologie

La technique la plus couramment utilisée est celle de l'immunofluorescence indirecte en uti­lisant comme support des hématies parasitées. Comme toute technique sérologique, elle nécessite des réactifs annexes (antiglobulines humaines...) ainsi qu'un microscope plus coûteux. Par ailleurs, elle ne peut répondre à l'urgence du diagnostic dans la mesure où le temps passé est long et surtout parce qu'un résultat négatif ne peut exclure un accès palustre.

La sérologie est surtout utilisée au plan épidé­miologique et pour le diagnostic de certaines formes cliniques telle le paludisme viscéral évolutif, au cours duquel le taux d'anticorps est très élevé.

2. Recherche d'antigènes : tests de dépistage rapide TDR

Plusieurs kits sont commercialisés. Des anti­corps monoclonaux dirigés contre ces enzymes sont fixés sur une bandelette de nitrocellulose ; après la mise en contact avec le sang, la présence de l'antigène est visualisée par action d'un deuxième anticorps révélateur (mono ou polyclonal selon le test utilisé). La réponse est rapide (moins de 15 minutes), visuelle sous forme d'un trait sur la bandelette et théoriquement, elle ne nécessite pas de compétence particulière. Actuellement, l'utilisation de ces tests tend à se généraliser mais comme examen complémen­taire en cas de doute diagnostique ou de traite­ment antipaludique préalable. Ces tests sont d'interprétation plus délicate en zone d'endé­mie et l'OMS a récemment fait le point sur leurs intérêts et limites, voir chapitre suivant.

3. Détection d'acides nucléiques spécifiques (P.C.R.)

Il s'agit certainement de la technique la plus sensible mais qui ne peut en aucun cas répondre au diagnostic d'urgence. Elle est très coûteuse, nécessite un équipement et une compétence très particuliers. Elle permet une différenciation de souches et on la réserve essentiellement à l'étude des mutations et des gênes impliqués dans la résistance. Les tech­niques de Biologie Moléculaire sont devenues indispensables au plan fondamental mais non utilisables pour le diagnostic biologique d'ac­cès palustre. Elles pourraient éventuellement être utiles pour le contrôle des donneurs de sang.

En conclusion

Lle diagnostic biologique du paludisme devrait pouvoir être effectué devant chaque suspicion clinique, afin de traiter de manière appropriée les individus parasités et limiter ainsi les traitements abusifs.

Des techniques indirectes ont fait leur appari­tion : la sérologie n'est pas adaptée au dia­gnostic d'accès palustre, les techniques de Biologie Moléculaire doivent être réservées à des laboratoires de recherche, quant aux TDR ils sont apparemment très attractifs mais pré­sentent un certain nombre d'inconvénients dont le coût.

Pour toutes ces raisons, la méthode de référen­ce reste encore l'examen microscopique d'un frottis-goutte épaisse coloré par le Giemsa.

Développement et Santé, n°189, 2008