Génétique et diagnostic biologique de la drépanocytose

Françoise Balédent Biologiste, Centre Hospitalier, 93205 Saint-Denis France.

Cet article a été récemment mis à jour. Vous pouvez le consulter ici.

La drépanocytose est une maladie héréditaire de l'hémoglobine, transmise de façon autosomale récessive, due à une mutation unique et ponctuelle du gène* béta globine situé sur le chromosome 11. Cette mutation est caractérisée par le remplacement d'un acide aminé par un autre (acide glutamique remplacé par une valine).
Cette hémoglobine anormale est appelée hémoglobine S (HbS). Elle présente une diminution de solubilité à l'état désoxygéné et, dans certaines circonstances comme l'hypoxie, l'acidose, la déshydratation, l'HbS se polymérise, entraînant une déformation des hématies en "faucille". Ces hématies sont alors détruites dans la circulation et cette hémolyse est responsable de l'anémie, d'où le nom de la maladie, encore appelée "anémie falciforme".

La drépanocytose est caractérisée par une grande hétérogénéité clinique : formes presque asymptomatiques à formes gravement invalidantes, voire létales dépendant en particulier de variations de l'environnement du gène au niveau du chromosome. Ces variations permettent de définir différents haplotypes.

La drépanocytose se manifeste biologiquement par une anémie hémolytique chronique.

I. Génétique

(cf. schéma en fin d'article)

La transmission de la maladie est autosomale récessive, c'est-à-dire indépendante du sexe et s'exprimant lorsque les deux chromosomes transmis par les parents sont porteurs du gène de la maladie.

Deux gènes béta hémoglobiniques s'expriment à égalité, l'un de provenance paternelle, l'autre d'origine maternelle.

Lorsqu'un seul chromosome est porteur du gène de l'HbS (transmis par la mère OU par le père), la maladie est dite hétérozygote, le porteur est sain.

Lorsque les deux chromosomes sont porteurs du gène (transmis par la mère ET par le père), la maladie est dite homozygote, le porteur est malade.

On distingue ainsi 3 génotypes majeurs :

  • AA homozygote normal,
  • AS hétérozygote asymptomatique,
  • SS homozygote drépanocytaire malade.

Il est donc possible de prévoir le risque d'atteinte des enfants en fonction du génotype des parents (cf. tableau ci-dessous):

  • Pour qu'un enfant soit malade, il faut que les deux parents soient transmetteurs, c'est-à-dire porteurs du gène de la drépanocytose.
  • Si les deux parents ne sont porteurs d'aucun gène (AA/AA), le risque est nul, les enfants seront AA.
  • Si l'un des parents est hétérozygote AS et l'autre parent normal (AS/AA), le risque de transmission du gène est de 50 %, les enfants porteurs étant alors tous hétérozygotes AS.
  • Si les deux parents sont hétérozygotes (AS/AS), le risque de transmission du gène est de 75% (risque AS = 50% et risque SS = 25%)
  • Si l'un des parents est normal AA et l'autre homozygote SS (AA/SS), le risque de transmission est de 100 %, tous les enfants seront AS.
  • Si l'un des parents est hétérozygote et l'autre parent homozygote (AS/SS), le risque de transmission du gène est de 100 % (risque SS = 50% et risque AS = 50%).
  • Si les deux parents sont homozygotes (SS/SS), le risque de transmission est de 100 %, tous les enfants seront homozygotes SS.

Important : pour tous les enfants issus de mêmes parents, le risque sera toujours le même. Par exemple, si l'un des parents est hétérozygote et l'autre parent homozygote (AS/SS) et si le premier enfant est SS, le deuxième enfant a toujours le même risque de 50 % d'être aussi SS.

Père -----> Mère l v AA AS SS
AA AA = 100 % AA = 50 % AS = 50% AS = 100%
AS AA = 50% AS = 50% AA = 25% SS = 25% AS = 50% AS = 50% SS = 50%
SS AS = 100% AS = 50% SS = 50% SS = 100%

II. Diagnostic biologique

1. Numération Formule Sanguine

Elle précise l'importance de l'anémie qui est variable, le taux d'hémoglobine variant en moyenne de 6 à 10 g/dI.
Il est important de connaître le taux d'hémoglobine basal afin d'évaluer les variations par rapport au taux habituel d'un patient. L'anémie est normochrome normocytaire. L'examen du frottis sanguin révèle la présence d'hématies en forme de "faucille" ou drépanocytes (figure 1), caractéristiques de la maladie. Les hématies ont une forme allongée, aux deux extrémités pointues, elles sont donc différentes des ovalocytes, ou elliptocytes, dont les extrémités sont arrondies (figure 2).

Le taux de réticulocytes est très élevé, sauf en cas d'érythroblastopénie.

La présence de corps de Jolly accompagne une atrophie splénique, on peut également retrouver une polychromatophilie, des ponctuations basophiles.
Le nombre d'érythroblastes circulants est variable, pouvant être très élevé au cours des accidents hémolytiques aigus.

Il est très important de les compter et de rectifier éventuellement le chiffre des globules blancs (les érythroblastes sont nucléés et comptés avec les leucocytes par les automates).

Il s'agit essentiellement d'érythroblastes polychromatophiles ou acidophiles (figures 3 et 4).

2. Bilan de l'hémolyse

La bilirubine libre est augmentée.
L'haptoglobine est effondrée.

3. Le test de EMMEL ou test de falciformation (tableau 1)

L'examen du frottis sanguin peut être négatif, il est alors possible de déclencher au laboratoire la falciformation, soit en rajoutant du métabisulfite au sang du malade, soit en créant artificiellement une atmosphère pauvre en oxygène.

On observe alors à l'état frais, entre lame et lamelle, les hématies qui prennent progressivement la forme typique en "faucille".
Le test est positif chez les drépanocytaires homozygotes et hétérozygotes.

4. Le test d'ITANO ou test de solubilité (tableau 2)

L'hémoglobine S, réduite par action d'hydrosulfite de sodium, précipite dans une solution de phosphate 2,24 M. Ce test est très utile, mais n'est que semi-quantitatif et n'est pas spécifique à 100 %, car d'autres hémoglobines, plus rares, peuvent également précipiter.
Il peut être faussement négatif chez le nouveau-né ou chez un porteur avec un taux faible d' HbS.
Comme pour le test d'EMMEL, un test positif ne permet pas de préciser s'il s'agit d'une drépanocytose homozygote ou hétérozygote.

5. L'électrophorèse de l'hémoglobine (tableaux 3 et 4)

Elle permet de poser le diagnostic en mettant en évidence la présence d'une fraction d'hémoglobine de migration différente des hémoqlobines normales.

Elle permet également de différencier les formes homozygotes des formes hétérozygotes, ainsi que la présence éventuelle d'une autre anomalie de l'hémoglobine associée (autre mutation ou thalassémie).

Le sang veineux est prélevé sur anticoagulant, principalement EDTA qui permet d'effectuer sur le même tube la NFS.
Le sang est ensuite lavé en eau physiologique et les hématies sont lysées. Cet hémolysat permet l'étude de l'hémoglobine.
L'électrophorèse de l'hémoglobine permet d'obtenir une séparation des différentes hémoglobines selon leur charge électrique et leur poids moléculaire.
Elle peut être pratiquée :

  • sur acétate de cellulose en milieu alcalin, pH 8,6 = technique la plus utilisée,
  • sur agarose en milieu acide, pH 6,2 qui permet de confirmer certaines hémoglobines anormales, en particulier en séparant les HbS, HbD, HbC et HbE.

L'hémoglobine normale adulte est composée d'hémoglobine A en grande majorité avec un taux d'hémoglobine A2 inférieur à 3,5 %.

Le sujet drépanocytaire ne possède pas d'hémoglobine A, mais il existe un taux variable d'hémoglobine A2 (2 à 4 %) et surtout d'hémoglobine F (1 à 15 %). Chez le sujet normal, l'hémoglobine F ou hémoglobine foetale, est présente en grande quantité à la naissance et le taux diminue progressivement pour disparaître vers l'âge de un an.

Il est intéressant de connaître le taux basal d'HbF. Cette hémoglobine diminuant le risque de falciformation, une drépanocytose homozygote avec un taux élevé d'HbF est de meilleur pronostic. Par ailleurs, les patients traités par Hydréa ont une augmentation de leur taux d'HbF.

Chez un individu drépanocytaire homozygote, l'électrophorèse révèlera donc trois bandes de migration :

  • HbS : 75 à 95 %
  • HbA2 : 2 à 4 %
  • HbF : 1 à 15 %

Le diagnostic de drépanocytose est confirmé par la présence majoritaire d'HbS. Chez le sujet hétérozygote, le taux d'HbS est inférieur à 30 %.

Chez certains malades, lorsque deux mutations sont associées on parle de double hétérozygote ou d'hétérozygotie composite. Ces hétérozygoties composites (SC, Sβthal, SD punjab, SO arab...) conduisent aussi à un syndrome drépanocytaire symptomatique. Le diagnostic biologique doit être confié à un laboratoire spécialisé.

6. Isofocalisation électrique

Elle est effectuée sur un support de polyacrylamide chargé d'ampholytes et en présence d'un gradient de pH.

Cette technique est plus sensible et plus spécifique mais également plus coûteuse. C'est la méthode de choix pour les nouveaux-nés. Le prélèvement peut être réalisé sur du papier buvard et être transmis dans un laboratoire de référence utilisant cette technique. D'autres techniques peuvent être utilisées : dosage spectrophotométrique d'HbS et HbA2 après séparation sur microcolonnes échangeuses d'ions, HPLC (Chromatographie liquide de haute pression) pour des laboratoires spécialisés.

7. Biologie moléculaire

Le diagnostic est effectué par PCR (polymerase chain reaction) en utilisant des sondes nucléotidiques de synthèse reconnaissant les séquences mutées et normales. Le diagnostic est effectué après amplification génique de l'ADN de la séquence correspondant à la mutation. Cette technique est réservée aux laboratoires spécialisés.

  Normal Nouveau-né Normal Adulte Hétérozygote Drépanocytose homozygote Double hétérozygote
Hémoglobine A F > 80% A2 A A2 < 3,5% A S = 35 à 45% A2 < 3,50% S > 90% F = 2 à 20% A2 < 3,50% S C
Tableau 1 : test de falciformation
Matériel et réactif :
  • Lame et lamelle de verre - Solution de métabisulfite de sodium à 2 % préparée
  • Boîte de Pétri avant chaque utilisation :
  • Pipette pasteur . métabisulfite de sodium (Na2S2O5) 0,50g
  • Eau distillée q.s.p 25 ml
Technique :
  • déposer une petite goutte de sang capillaire (prélevé sur EDTA) au centre de la lame,
  • ajouter une goutte de métabisulfite de sodium, d'un volume égal, mélanger soigneusement avec le coin d'une lamelle,
  • couvrir avec la lamelle en s'assurant qu'il ne se forme aucune bulle,
  • placer la lame sur deux batonnets dans une boite de Pétri, dont le fond est garni de papier filtre humide, pour éviter la déssication de la préparation,
  • attendre 15 mn,
  • examiner la lame au microscope : si le résultat est négatif, répéter la lecture après encore 15 mn, puis 1 heure et a nouveau 2 heures plus tard.
Résultats :
  • si le test est négatif, les hématies gardent leur forme ronde,
  • si le test est positif, les hématies prennent progressivement une forme de faucille ou de banane aux extrémités pointues, souvent dentelée.
Il est recommandé d'examiner plusieurs zones de la préparation car la falciformaltion ne s'effectue pas de façon homogène. Il ne faut pas confondre les hématies falciformes avec des hématies crénelées (échinocytes) qui n'ont pas les extrémités pointues.
Tableau 2 : test d'Itano ou test de solubilité sur sang total
Principe : L'hémoglobine S, réduite par action de l'hydrosulfite de sodium, précipite dans une solution tampon phosphate de 2,24 M. Réactifs :
  • hydrosulfite de sodium : Na2S2O4
  • solution tampon 2,8 M en phosphate pH 6,8 :
      * K2HPO4 (1,62 M) anhydre : 28,2 g* K2HPO4 (1,18 M) anhydre : 16 g* H2O fraichement distillée ou déminéralisée : QSP 100 ml
   Conservation à température ambiante
  • solution A :  Hydrosulfite de sodium : 25 mg
                              Solution tampon 2,8 M: 2 ml                               Bien dissoudre Technique : Le test est réalisé à température ambiante (environ 20°C). 1° Préparer un hémolysat pour chaque échantillon à tester, à partir du culot globulaire lavé en eau physiologique :
  • culot globulaire = 100 ml
  • eau distillée = 600 ml
  • bien agiter les tubes et les laisser à + 4°C pendant 15 mn,
  • centrifuger 10 mn.
2° test :
  • faire un tube témoin :
      * solution tampon 2,8 M = 800 ml* hémolysat = 200 ml
  • tube test :
      * solution A = 800 ml* hémolysat = 200 ml
Procéder en déposant les hémolysats à la surface du tampon puis en agitant simultanément tous les tubes. Si l'on est en présence d'hémoglobine S, il se produit immédiatement un trouble net dans le tube contenant la solution A. Le tube témoin doit rester limpide.

Tableau 3 : schéma d'une électrophorèse

8. Facteurs modulant la maladie drépanocytaire

a) Haplotypes drépanocytaires

Le bilan biologique d'un patient drépanocytaire comporte l'identification de son haplotype (environnement chromosomique différent selon les populations), qui permet d'apporter un élément pronostic.

b) Le taux d'HbF

C'est un facteur pronostique important puisque des taux élevés, supérieurs à 10 %, inhibent partiellement la falciformation. L'HbF, visible à l'électrophorèse, est au mieux dosée par HPLC.

Diagnostic ante-natal

Il est possible, lorsque les deux parents sont porteurs de la mutation (_cf.figure transmission de la drépanocytose_), de proposer un diagnostic ante-natal :

  • par biopsie de trophoblaste à partir de la 11ème semaine, de grossesse,
  • par amniocenthèse à partir de la 17 ème semaine.
Tableau 4 : technique de l"électrophorèse de l"hémoglobine sur acétate de cellulose
### Réactifs #### 1\. Tampon A (solution mère)
  • Acide borique : H3BO3 ; 15,50 g ;  1,12 M
  • Trishydroximéthylaminométhane : 54,50 g ;  0,227 M
  • EDTA (Complexon III ) ; 2,90g ; 0,00385 M
  • H2O distillée : 2 000 ml
  • Ajouter ensuite : KCN 1,36 g
  • Conservation 15 jours à 4°C
#### 2\. Tampon B (solution mère)
  • Acide borique : H3BO3 19,28 g ; 0,155 M
  • Soude en pastilles :  3,784 g ; 0, 047 M
  • H20 distillée : 2 000 ml
  • Ajouter ensuite :  KCN 1,36 g
  • Conservation 15 jours à 4°C
#### 3\. Solution mère de tolidine
  • Tolidine : 1 g
  • Alcool éthylique absolu : 100 ml
  • Conservation 15 jours à 4°C
#### 4\. Solution fille de tolidine
  • Solution mère de tolidine : 5 ml
  • Acide acétique glacial : 1 ml
#### 5\. Réactif décolorant
  • Alcool méthylique :  800 ml
  • Acide acétique : 200 ml
  • Eau permutée ou eau distillée : 1 000 ml
#### 6\. Amido schwartz Solution à 0,5 g p.100 dans le réactif décolorant n° 2 #### 7\. Solution de transparisation
  • Méthanol 75 ml
  • Acide acétique 20 ml
  • Diacétone alcool 5 ml (hydroxy 4 méthyl 4 pentanone 2)
#### Matériel :
  • Cuve pour électrophorèse
  • Semi-micro-applicateur
  • Portoir
  • Bandes d'acétate de cellulose (17 cm x 2,5 cm)
#### Electrophorèse :
  • Mettre dans la cuve 350 ml de tampon B dilué 5 fois.
  • Mettre les bandes d'acétate de cellulose dans le tampon A dilué 5 fois, pendant 30 minutes. Sécher les bandes entre deux couches de papier filtre, les numéroter.
  • Les tendre sur le portoir, dans la cuve en mettant en contact les bords supérieur et inférieur avec le tampon contenu dans chaque compartiment de la cuve.
  • Faire 2 dépôts de 10 ml d'hémolysat par bande, à 3 cm du pôle négatif.
  • Faire migrer 2 heures à 200 volts, à 0,50 mA par bande, à température du laboratoire (environ 20°C).
  • Faire une bande pour chaque coloration (amidoschwarz et tolidine).
  • L'utilisation de bandes plus grandes (14 cm x 5,7 cm) permet de faire 4 dépôts.
#### Coloration :
  • Coloration à l'amidoschwartz :
      * Plonger les bandes dans le colorant filtré extemporanément, pendant 5 mn* Décolorer dans le réactif décolorant n°5 jusqu'à ce que le fond soit blanc.
  • Coloration à la tolidine :
      * Déposer la solution fille de tolidine (mélange n°4) sur les bandes* Rejeter l'excès, rincer rapidement à l'eau distillée* Verser de la solution H2O2 à 110 volumes diluée 20 fois* Rincer rapidement et abondamment à l'eau du robinet* Faire immédiatement un schéma de la bande +++* Cette coloration est en effet instable.
#### Transparisation
  • Déshydrater par le méthanol pendant environ 2 mn
  • Puis mettre la solution de transparisation pendant environ 2 mn Placer les bandes sur une plaque de verre propre. ++
  • Laisser sécher à température ordinaire pendant au moins 2 heures
  • Une lecture des bandes peut ensuite être effectuée à l'aide d'un densitomètre.

III. Conclusion

Le diagnostic de drépanocytose, évoqué par la clinique ou recherché dans le cadre d'une enquête familiale, est biologique. La présence, spontanée ou provoquée, de drépanocytes sur frottis sanguins est caractéristique de la maladie, mais c'est l'étude de l'hémoglobine qui permet d'affirmer le diagnostic. L'électrophorèse de l'hémoglobine est le plus souvent suffisante pour poser le diagnostic de drépanocytose.

*_Glossaire_**
Gène = "morceau" d'ADN, unité d'hérédité contrôlant un caractère particulier, située à un endroit précis (locus) sur un chromosome.
Locus = emplacement précis d'un gène sur un chromosome.
Allèle = une des différentes formes que peut prendre un gène sur un chromosome. Les allèles d'un gène occupent la même position (locus) sur un chromosome.
Haplotype : "blocs" d'allèles situés sur le même chromosome définis par l'association de plusieurs mutations.
ADN : molécules constituant les chromosomes et présentes dans les cellules de tous les êtres vivants, mais chaque ADN est unique pour chaque individu.

Développement et Santé, n°182, 2006